Ben Stiller coby Larry Daley, bývalý noční hlídač v Přírodovědném muzeu, kde v noci ožívají výstavní exponáty, musí se starými i novými přáteli čelit dalším nebezpečím. Egyptský faraón totiž hodlá převzít vládu nad muzeem Smithsonian Institut … a pak nad celým světem! V muzeu Smithsonian Institut ve Washingtonu nastala noc. Strážci odešli domů, světla zhasla, dětští návštěvníci jsou dávno ve svých postýlkách … a přesto je v „prázdném“ muzeu podivný šramot. Bývalý noční hlídač Larry Daley (Ben Stiller), který se stal vynálezcem a konečně má to, po čem toužil, je opět vtažen do neuvěřitelného dobrodružství, v němž ožívá sama historie. Larry ovšem na začátku netuší, že po jeho odchodu se nejoblíbenější exponáty (a zároveň jeho nejlepší kamarádi) ocitly v bednách, kde čekají na odvoz do ohromných depozitářů v největším muzeu na světě ve Washingtonu. Jejich další osud je velmi nejistý – alespoň do chvíle než miniaturní kovboj Jedediah (Owen Wilson) zavolá Larrymu a popíše mu hrozící katastrofu. Egyptský vládce Kahmunrah (Hank Azaria) s trojicí nenáviděných přisluhovačů, jmenovitě carem Ivanem Hrozným (Christopher Guest), císařem a vojevůdcem Napoleonem Bonapartem (Alain Chabat) a mafiánem Al Caponem (Jon Bernthal), zmobilizuje své přívržence a plánuje převrat. Nejprve chce ovládnout muzeum Smithsonian a pak rovnou celý svět. Rozhněvaný Larry rychle přijíždí do Washingtonu a při své záchranné misi se setká s několika výjimečnými novými přáteli: s excelentním Albertem Einsteinem, čestným Abrahamem Lincolnem i s okouzlující nezkrotnou Amelií Earhartovou (Amy Adamsová), jež v Larrym probudí ztracený smysl pro dobrodružství a zábavu. Po boku se starými kamarády, jako jsou Teddy Roosevelt (Robin Williams), Octavius (Steve Coogan), Sacajawea (Mizuo Peck), Hun Attila (Patrick Gallagher) a partička neandrtálců, se Larry nezastaví před ničím, a dříve než se rozední, nastolí v muzeu pořádek. Noc v muzeu 2 je historicky první film, který se natáčel v komplexu Smithsonian – největším a nejnavštěvovanějším muzeu světa.